发布时间：2023-12-05 01:54来源：www.sf1369.com作者：宇宇
样品在跑电泳前，做浓度测定，然后统一上样量。
如果考虑不同组织差异性的考察，可以根据实验需要进行调整。
切记，做好实验数据记录。
生物膜上含有的H、C、P等具有非零自旋的磁性核 ，当与外磁场和射频场相互作用，并且满足共振条件时，将吸收射频场能量而发生自旋能级间的跃迁，这就是核磁共振(NMR)的基本原理。由于NMR技术可以对含水样品进行非破坏性测量，从而使观测能在接近生理条件下实现，并可通过生物膜上H、C和P进行综合研究，尤其是可以从原子或基团水平上提供分子的动态结构和运动的信息，是研究生物膜结构的有力工具。
生物膜主要由蛋白质和脂质组成，结构比较复杂，而磷脂脂质体却能表现出生物膜结构的许多性质，是生物膜的理想模型。磷脂脂质体主要以凝胶相和液晶相存在，在凝胶相，分子的局部运动很慢，分子间和分子内的偶极相互作用没有被有效地平均，所以NMR谱线很宽，得到的信息非常少;而在液晶相，分子局部运动受到的限制减少，运动加快，从而使NMR谱线窄化，得到高分辨的NMR谱。
NMR技术在生物膜结构研究中应用非常广泛。用H、C和P NMR谱可以鉴定磷脂的种类。通过弛豫时间测定的方法可以研究磷脂双分子层不同部位的流动性。将磷脂分子不同位置的氢选择氘代，用H四极分裂和P化学位移各向异性的方法可以研究磷脂脂酰链的流动性、极性基团的构象以及磷脂与其它分子的相互作用(蛋白质、药物和金属离子等)，利用P化学位移各向导性方法可以研究磷脂的多形性。近年来，随着NMR技术的发展，二维(2D)和固体高分辨NMR技术也被应用于生物膜研究领域，并且已成为非常重要的手段。利用通过化学键建立的相关谱(如COSY等)可以进行多组分磷脂或磷脂与其它分子混合体系每个基团的谱线归属。而通过空间建立的相关谱(如NOESY等)可以直接提供基团之间距离的信息，是研究膜脂结构以及与其它分子相互作用的有力工具。固体高分辨技术不仅可以研究液晶态的磷脂，而且可以应用于凝胶态磷脂的研究中。
对于某一种磁性核，其磁矩在磁场中可以有不同的取向。对于质子而言，可以有两种取向，即与静磁场平行和反平行，前者属于低能态，后者属于高能态。如果在垂直于静磁场的方向上加一个射频场，当射频场的频率与核的Larmor频率(核磁矩绕磁场方向进动频率)相等时，处于低能态的核子便吸收射频能，跃迁到高能态。射频场去掉后，高能态的核子通过弛豫过程又回到低能态，从而就能观察到NMR的信号。弛豫过程有两种，一种是自旋—晶格弛豫，此过程用T1表示;另一种是自旋—自旋弛豫，用T2表示。T1是描述自旋体系吸收能量后将其能量转移给它周围环境而恢复到平稳态的时间，T2过程中自旋体系内部有能量的偶合，自旋体系总能量没有变化。弛豫时间与分子运动有关，通过弛豫时间的测定，可以研究生物膜各部位的流动性。
生物膜C和P化学位移各向异性与运动有很大关系。所谓化学位移各向异性，是指核所处的静磁场方向改变，核的共振频率(即化学位移)就发生变化，由于I=的核周围电子密度分布是球对称，所以如果静磁场方向改变， 核的有效感应磁场也就随之变化，处于不同形态，其运动方式不同，因而化学位移被平均的取向也不同。通过P化学位移各向异性可以研究磷脂的多形性;此外，还可以用I=1的H各向异性(四极分裂)谱研究磷脂分子空间取向的平均分布信息。
2D NMR有别于常规一维(1D)NMR的主要点在于1D NMR只涉及一个频率变量，是吸收峰强度对一个频率变量作图;而2D NMR谱则代表两个独立频率，是吸收峰强度对两个频率变量作图。一般将2D NMR实验分4个区域，即预备期、发展期(t1)、混合期(可以没有)和检测期(t2)。预备期是为了使磁化矢量达到适当的初始态而设置的，接着在发展期磁化矢量进行演化，在混合期内自旋系统发生相干转移，最后在检测期信号被检测。逐次改变t1反复循环累加，最后将所得数据进行两次傅里叶变换：即可得到2D NMR谱。2D NMR谱可分为通过化学键和空间建立起来的两类相关谱，两类2D NMR谱对谱线归属都非常重要，后者对于生物膜分子空间构象研究也非常有力。
综上所述，核磁共振分析方法在生物研究 上的应用主要有以下几个方面： 测定溶液中生物大分子的三维空间结构； 分析生物大分子在溶液状态下的分子动力学； 研究蛋白质的相互作用和酶的作用机理等； 解析固体膜蛋白和纤维蛋白的结构和运动性质； 基于蛋白质靶点的药物筛选和设计； 研究活体状态下生物分子的功能活动和生理代谢。
1.研究生物组织中的自由基
在冻干的动物组织和植物组织内均检测出自由基，而在代谢过程活跃的组织（如绿叶、肝、肾）样品内，自由基含量很高。又在蚁、果蝇、活鼠鼠尾。腐黑物、植物树脂和各种动物与植物来源的黑素内均测知有自由基存在。
2.研究酶促反应中的自由基
直接证实了L·米夏埃利斯关于生物底物的氧化有阶段性的假说（见生物氧化），已知有半醌型自由基作为中间产物生成，自由基浓度随着电子转移速率或酶活性而增大。在某些情况下，可利用超精细结构来鉴定自由基，并进而提供关于酶催化机理的信息和探测有关酶的活性部位的结构。
3.研究光合原初反应
证明在叶绿体、活的水藻和能进行光合作用的细菌中有光照所引起的自由基生成，它们全部参与光合电子传递链。这有助于阐明太阳能转换成化学能的本质。
4.研究辐射原初过程
对于生物物质受高能辐射作用后所产生的自由基作定性与定量的检测，已提供了辐射损伤程度及损伤部位的信息。还从较深入的研究得出涉及辐射效应的原初机理、氧效应、能量转移、自旋转移、生物物质的辐射敏感性、辐射防护和辐射敏化的许多极为重要的结果。
5.研究癌变过程中的自由基
已观察到某些癌组织内的自由基含量高于正常组织。在用多种致癌物喂大鼠后，肝内可检出一个特征信号，在癌的诊断中可能有重要价值。还证明了由致癌物在组织中形成自由基的现象。
6.研究生物组织中的顺磁金属离子
包括过渡族金属离子，对一些动物组织、植物材料和微生物都能见到铜（Ⅱ）、锰（Ⅱ）或铁的EPR信号。已用EPR技术证实了一些含顺磁性金属的酶的活性与这些金属的原子价态直接有关，这些金属离子可能参与底物与酶的结合，例如黄嘌呤氧化酶中的钼、琥珀酸脱氨酶中的铁、血浆铜蓝蛋白中的铜。
对血红蛋白、肌红蛋白及其数种衍生物的单晶，用EPR法测出的血红素平面对外界晶轴的取向，比用别的方法所得结果更准确，且提供了有关分子中央铁原子的化学键的信息，井证明血红蛋白分子内4个血红素平面并不相互平行。
许多铁硫蛋白的发现，多半是由于电子顺磁共振测定结果，在其活性部位的鉴定和了解结构与功能的关系方面，电子顺磁共振亦作出了主要贡献。