做流式细胞分析的血液怎么处理

一、做流式细胞分析的血液怎么处理

所用的血红细胞标准样品制作过程：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：血=1：4），经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为血红蛋白的自发荧光。

二、流式细胞仪测ROS最终结果如何处理

流式检测ROS的特异性比较差。一般来说，针对过氧化氢和超氧化物有荧光探针。加到细胞培养液后，细胞摄龋遇到ROS，可以发出荧光，上机检测可以比较各组之间荧光强度的变化从而代表ROS水平的不同。

三、请教：流式分选细胞前标本的处理以及注意事项

具体步骤都繁琐且每实验都尽相同能告诉些原则： 第步设计选标记表面抗体标记标记诱导细胞激影响游实验些都要弄明白 第二步选择所要用仪器兼容荧光素比实验室仪器没紫外激光选用紫外荧光才能激发荧光素仪器能识别 第三步准备单细胞悬液要根据实验材料培养细胞整块组织或者悬浮细胞同需要找自优化原则限度细胞且保持细胞处于非粘附状态 第四部染色 第五部选根据实验要求收集管或者9陆孔盘每孔细胞根据实验要求

四、藻细胞进行流式细胞检测之前应该怎么处理

根据你所购买的试剂盒而定,一般是先用70%乙醇先固定,然后加RNA酶和PI,半个小时左右上机检测就可以了.需要注意的就是加酒精固定的时候要用四度预冷的酒精,缓慢的加,边加边晃动细胞,避免细胞黏连在一起.

（1）细胞培养

取对数生长期的细胞，按1X106个/mL以1mL体积接种于6孔板内。培养24h后，加入不同浓度样品。在37 ℃、5 % 的CO2恒温箱中培养24h后终止。

（2）细胞固定

胰酶消化并离心收集细胞（800rpm/min），弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇， -20℃固定保存。

（3） 细胞染色

离心收集细胞（800rpm/min），以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A, 4℃避光孵育20分钟。

（4）检测

以标准程序用流式细胞仪检测，汞激发波长488nm，计数8千个细胞，结果用软件WinMDI Version 2.9分析。

五、流式细胞仪的原理和操作过程

原理：

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

操作过程：

①打开电源，对系统进行预热；

②打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；

③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的 基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭 气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

⑧将所需结果打印出来。